實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

為了解大鼠肺組織中炎癥因子蛋白表達(dá)情況，需要將組織內(nèi)的蛋白盡量釋放并收集，使用研磨和超聲手段，對(duì)肺組織進(jìn)行勻漿和細(xì)胞破碎，最終分離得到溶液中的蛋白進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，從而了解蛋白表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)步驟

取0.2g大鼠右肺組織樣本，切碎，取適量溶解并混勻后的RIPA裂解液，使用前加入酶抑制劑，在每100 mg右肺組織樣本內(nèi)加入 1 mL 的RIPA裂解液，后使用SCIENTZ-24高通量組織研磨器將組織充分研磨勻漿，于4℃的條件下裂解30～60 min，將裂解后的組織置于SCIENTZ-1500F超聲分散儀上破碎，用高速離心機(jī)10000r/min離心10min，取上清液。提取總蛋白并利用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，于100℃水中煮5min，使蛋白變性后，置于冰上使其驟冷，提取為實(shí)驗(yàn)使用的蛋白樣本，置于－20℃冰箱中冷凍保存。使用蒸餾水清洗干凈灌膠玻璃板，豎直放置使其自然晾干。分別使用分離膠、5%濃縮膠處理后，將凝膠置于電泳槽進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到預(yù)先準(zhǔn)備的 NC 膜上，制備轉(zhuǎn)膜“三明治”，在電轉(zhuǎn)儀中轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，搖床洗膜，封閉液封閉1～2 h倒掉封閉液，加入稀釋的相應(yīng)抗體。在搖床上4℃過夜，TBS－T洗膜3次，每次10 min，加入二抗。二抗孵育結(jié)束后，于搖床上用TBST洗膜5～10min×3次。加ECL工作液于印跡膜上30～60s，吸干發(fā)光液，置印跡膜于成像分析儀自動(dòng)成像，軟件ImageJ分析蛋白條帶灰度值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠肺組織中IL－17、IL－22、IL－10、IL－35蛋白表達(dá)情況比較與空白組比較，模型組和假 貼組肺組織中 IL－17、IL－22蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均＜0.05)，IL－10、IL－35蛋白相對(duì)表 達(dá)量均明顯降低(P均＜0.05) ; 與模型組和假貼組比較，地塞米松組、發(fā)酵組、非發(fā)酵組肺組織中IL－17、IL－22蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均＜0. 05)，IL－10、IL－35蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高( P均＜0.05) ; 地塞米松組、發(fā)酵組、非發(fā)酵組間各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P均＞0.05)。

表1 空白組和支氣管哮喘各組大鼠肺組織中IL－17、IL－22、IL－10、IL－35蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)

圖一空白組和支氣管哮喘各組大鼠肺組織中IL－17、IL－22、IL－10、IL－35蛋白表達(dá)電泳圖